超分辨STED显微镜对于样品的要求多不多

超分辨STED显微镜对样品的要求较多，涉及厚度、光学特性、荧光标记、盖玻片与封片剂选择及活细胞成像条件等多个方面，具体如下：

样品厚度：STED显微镜要求样品厚度通常不超过80微米，*佳厚度在20微米以内。若样品过厚，需使用特殊物镜（如水镜）或牺牲部分分辨率，且厚样品可能因球差和畸变影响成像质量，需通过自适应光学技术矫正。

光学特性：样品需对受激辐射光无吸收，避免信号干扰。例如，某些染料或材料可能吸收STED损耗光（如775nm激光），导致分辨率下降或成像失败。

荧光标记：

染料选择：需根据STED损耗光的波长（如592nm、660nm、775nm）选择匹配的荧光染料。例如，针对592nm损耗光，推荐使用mTFP1、eGFP等染料；针对775nm损耗光，推荐使用SiR Dyes、Alexa Fluor 647等染料。

标记密度：需优化标记密度，避免过度标记导致荧光信号饱和或背景噪声增加。

荧光亮度与信噪比：样品需具备足够的荧光亮度和信噪比，否则STED效果可能较差或无法进行Z轴堆叠成像。

盖玻片与封片剂：

盖玻片：推荐使用标准厚度（0.170±0.01毫米）的盖玻片，以确保光学路径的稳定性。

封片剂：需选择折射率接近1.518且不被损耗光激发的封片剂。例如，甘油与碳酸盐缓冲液的混合液、含防淬灭剂的ProlongGold或Mowiol封片剂是推荐选择；而Vectashield、DABCO/NPG等封片剂可能不适用。

活细胞成像条件：

光漂白与光毒性：STED显微镜的强激光可能对活细胞造成光损伤，需通过自适应照明技术（如RESCue、DyMIN）降低光照量，减少光漂白和光毒性。

细胞状态：活细胞需保持良好状态，避免因制备过程（如固定、脱水）导致细胞结构破坏或荧光信号减弱。

背景荧光控制：

避免强背景荧光：某些染料（如DAPI、Hoechst）可能被STED激发光激发，产生强背景荧光，影响成像质量。需选择替代染料（如Picogreen标记细胞核）或优化成像参数（如调整激光功率、检测波长）以降低背景。

多通道成像顺序：

扫描顺序优化：在多通道STED成像中，需注意扫描顺序。例如，592nm的受激辐射光可能漂白大多数红色或红外荧光染料，需合理安排通道扫描顺序以避免信号损失。