透射荧光显微镜与反射荧光显微镜的区别及优缺点

透射式荧光显微镜：激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的。常用暗视野集光器，也可用普通集光器调节反光镜使激发光转射和旁射到标本上。这是比较旧式的荧光显微镜。其优点是低倍镜时荧光强，而缺点是随放大倍数增加其荧光会减弱．所以对观察较大的标本材料较好。

落射式荧光显微镜：这是近代发展起来的新式荧光显微镜，与上面不同的是激发光从物镜向下落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜。光路中需加上一个双色束分离器，它与光铀呈45度角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，反回到双色束分离器，使激发光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。如换用不同的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的组合插块，可满足不同荧光反应产物的需要。这种荧光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清晰，放大倍数越大荧光越强。

透射荧光显微镜的优点及缺点：

光源：高压汞灯或卤素灯。

聚光镜：使用暗场聚光镜，使激发光和荧光分离出来。

物镜：可用任何种类的物镜。

标本：因为是透射观察，薄一些的标本比较适合。

优点：

①由于用了暗场聚光镜，激发光不能进入物镜，因此容易形成暗的背景，得到良好的反差，且任何物镜都可用于观察。

②用低倍物镜时，比反射荧光显微镜更亮。

缺点：要正确调整聚光镜中心和高度，否则不能获得明亮的荧光像。由于暗视场聚光镜焦距限制，不能使用厚的载玻片。视场照明区不能过大，否则容易使荧光标本荧光色衰退。厚的或不透明的标本不适用。

反射荧光显微镜的优点及缺点：

光源：高压汞灯或卤素灯。

聚光镜：因为物镜作为聚光镜，所以不需要聚光镜。

物镜：所用物镜要能透过足够的紫外光，而且本身不产生荧光，对数值孔径没有限制。

标本：厚的标本或不透明的标本都能观察。

优点：

①由于物镜兼作聚光镜，不需要很多调节。

②采用柯勒式照明法，可利用孔径光阑和视场光阑的效果。

③物镜数值孔径不受限制，在高放大倍率时，也可以获得高分辨率的像。

④厚的或不透明的标本也能观察，厚的盖玻片也能使用。

⑤其它观察法也能与反射荧光结合使用，特别和相差法和透射微分干涉差法相结合。

⑥可以避免不必要的荧光色衰退现象。

缺点：在用低倍率物镜时，像比较暗，因此要用大数值孔径的物镜。滤光镜系统要有效地分离开激发光和荧光。